超低溫保存的注意事項及面臨的挑戰(zhàn)

冰凍和解凍對大多數(shù)細胞都是嚴重的脅迫，通過控制冷凍和解凍的速度以及改變細胞和細胞質(zhì)的化學環(huán)境來改變。冰凍配子和胚胎在人類生育管理上的越來越重要。如下報告將解析超低溫保存的注意事項及面臨的挑戰(zhàn)：

　　在冰凍過程中，主要的脅迫來自：①暴露在低溫下;②冰晶的機械、物理效應;③胞外溶液性質(zhì)的改變;④胞內(nèi)溶液類似性質(zhì)的改變。超低溫損傷的一個原因，可能是細胞本身沒有結(jié)冰時溫度下降對細胞結(jié)構(gòu)和功能的影響。若發(fā)生這種直接的低溫損傷，則在降溫過程中會很快地表現(xiàn)出來并取決于冷凍速度，隨冷凍速度增加而增加。這種損傷在很多細胞包括細菌、酵母、原生生物、藻類、高等植物和哺乳類細胞系中都可觀察到。

　　在水溶液環(huán)境的細胞系統(tǒng)中，冷凍速度慢將導致胞外結(jié)冰，而細胞仍未結(jié)冰，不過已處于超冷卻狀態(tài)(即處于溶液冰點以下，但無冰晶形成)。胞外結(jié)冰的主要后果是溶質(zhì)從冰晶中排出，并在剩余的液體部分積累。這小部分溶液很快積累大量溶質(zhì)，因而對細胞造成了高滲環(huán)境，以致未結(jié)冰細胞的滲透脅迫也就增加 (圖1)。細胞的反應表現(xiàn)為失水、體積減少，并且因細胞膜的表面積減少可能遭受一系列機械損傷。這些損傷包括由于細胞收縮引起質(zhì)膜物質(zhì)丟失，這可能導致解凍過程中隨著細胞恢復其原來的體積而發(fā)生胞溶作用。顯然，在這種低溫脫水過程中，未冰凍細胞的細胞質(zhì)將更加濃縮，其細胞器將和整體細胞一樣遭受后面損傷性的滲透脅迫效應。細胞外的冰晶和未結(jié)冰溶液將同時存在，直至達到溶液的共溶溫度，在這種溫度下，溶質(zhì)開始晶體化。

　　圖1 不同零下溫度下未結(jié)冰水的百分數(shù)和未結(jié)冰NaCl溶液中溶質(zhì)的摩爾數(shù);

　　起初NaCl摩爾數(shù)為0.15M(引自Grout和Morris，1987)

　　超低溫保存技術(shù)將面臨的挑戰(zhàn)：

　　1、要盡可能改進技術(shù)線路，以便發(fā)展中國家可以立即在農(nóng)作物的保存和改良、以及生物技術(shù)和醫(yī)療保健的開發(fā)上獲得益處。實現(xiàn)這一目標的重要步驟，就是發(fā)展和生產(chǎn)在技術(shù)不可靠的條件下性能可靠的廉價冰凍設備。第二步目標是大器官(例如腎)的超低溫保存，以方便移植手術(shù)的器官供應。這里面的困難包括尋找適合保存大器官時不可避免的熱傳遞問題。

　　2、用單一方案保存多種類型的細胞不是不能實現(xiàn)，這在生長后期的軟體動物幼體保存中已被證實。這些動物直徑在0.5mm以上，并具有發(fā)達的功能肌肉、帶消化組織的內(nèi)臟、活躍的纖毛和神經(jīng)、循環(huán)組織。由于這些幼體體積小，表面積/體積較大，熱傳遞可能不會受到很大的限制。不過，在更大的器官中例如哺乳動物的腎，傳遞關系很復雜，可能成為冷凍和脫水的重要限制因子。這些物理問題可能比細胞的多樣性、對超低溫保存的成功造成更大的影響。

　　超低溫保存應用：

　　已證明液氮保存適應于一系列細胞、組織和有機體(例如細菌、酵母、血紅細胞、雜交瘤、哺乳動物配子和高等植物培養(yǎng)細胞)，并且已成功地開發(fā)其商業(yè)價值，特別是牛精子和胚胎，以及近的軟體動物幼體。